免疫荧光三标实验报告（TSA法 冰冻切片）

一、实验器材及试剂

1、实验器材

2、主要试剂及货号

3、抗体信息

（1）一抗信息

（2）二抗信息

4、注：一抗及二抗信息根据具体实验条件填写。

二、实验步骤

1、冰冻切片固定：冰冻切片室温晾干，常规固定，于蒸馏水洗涤3次，每次5分钟。

2、抗原修复冰冻切片常规不修复，特殊情况可选择性的进行抗原修复。

3、画圈：组化笔画圈后，将切片置于TBST中。

4、破膜：用0.1%Triton®X-100破膜15分钟。TBST洗3次，每次5分钟。

5、阻断内源性过氧化物酶：将切片浸泡于3%H2O2中，室温避光阻断20分钟，蒸馏水浸洗后，浸泡于TBST中。

6、封闭：滴加与二抗来源一致的10%血清，37℃孵育30分钟。

7、孵育第一种一抗甩去血清，用10%血清稀释一抗原液，配制成一抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）一抗工作液，4℃孵育过夜。

8、孵育二抗第二天从冰箱拿出切片，置于室温放置15分钟（复温），用TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。用TBST稀释二抗原液，配制成二抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）二抗工作液，37℃孵育45分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

9、TSA染色：甩去TBST，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）酪胺盐工作液，避光室温孵育10分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

10、洗脱：切片上滴加洗脱液，于烘箱内37℃洗脱45分钟。洗脱完后，TBST浸洗3次，每次5分钟。

11、封闭：滴加与二抗来源一致的10%血清，37℃孵育30分钟。

12、孵育第二种一抗：甩去血清，用10%血清稀释一抗原液，配制成一抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）一抗工作液，4℃孵育过夜。

13、孵育二抗：第三天从冰箱拿出切片，置于室温放置15分钟（复温），用TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。用TBST稀释二抗原液，配制成二抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）二抗工作液，37℃孵育45分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

14、TSA染色：甩去TBST，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）酪胺盐工作液，避光室温孵育10分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

15、洗脱：切片上滴加洗脱液，于烘箱内37℃洗脱45分钟。洗脱完后，TBST浸洗3次，每次5分钟。

16、封闭：滴加与二抗来源一致的10%血清，37℃孵育30分钟。

17、孵育第三种一抗：甩去血清，用10%血清稀释一抗原液，配制成一抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）一抗工作液，4℃孵育过夜。

18、孵育二抗：第四天从冰箱拿出切片，置于室温放置15分钟（复温），用TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。用TBST稀释二抗原液，配制成二抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）二抗工作液，37℃孵育45分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

19、TSA染色：甩去TBST，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）酪胺盐工作液，避光室温孵育10分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

20、染核：除去TBST，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）DAPI工作液（用DAPI原液1:500配制），避光染核5分钟后，用TBST冲洗。

21、封片：用荧光封片剂封片，4℃避光保存。

22、镜检：显微镜下镜检，图像采集分析。

三、结果判读

DAPI通道细胞核为蓝色，430通道阳性为青色，FITC通道为绿色，Cy3通道阳性为橙红色，Cy5通道阳性为紫红色，Cy7通道为近红外。