Western blot实验报告

一、实验器材及试剂

1、实验器材

2、主要试剂及货号

3、试剂配方

（1）5%积层胶所用溶液（按总体积2.5ml）

（2）分离胶溶液配方参考表

（3）电泳缓冲液，1L

3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸馏水至IL。

（4）电泳转移缓冲液，1L

3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、甲醇200ml, 加蒸馏水至1L。

（5）5×样品缓冲液，10ml

0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Ph6.8）、5ml 50%的甘油、2ml 10%的SDS、0.5ml 2-巯基乙醇、1ml 1%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水，可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。

二、蛋白提取（根据样品及检测要求选取适当提取方法）

组织样本

1、组织块剪成小块置于匀浆管中，加入1-3个匀浆珠，加入5-10倍组织体积的裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），设置匀浆程序进行匀浆。

2、将匀浆完成的匀浆管取出，放置冰上裂解液30min，每隔5min震荡一次确保组织完全裂解。

3、10000rpm，4℃离心10min，取适量上清置于新的1.5ml离心管中，-80°C保存。

细胞样本

1、弃去培养基，用预冷PBS清洗细胞，加入总蛋白提取液，充分吹打,然后冰上放置10~20min后，将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。

2、10000rpm，4℃离心10min，取适量上清置于新的1.5ml离心管中，80°C保存。

三、蛋白浓度测定

1、采用BCA法测定浓度。

2、操作步骤：

标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂：

3、样品浓度测定，1μl待测蛋白和19μl 0.9%生理盐水。

4、根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。

5、各孔加入200μl BCA工作液。

6、把酶标板放置37℃ 30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量（μg）为纵坐标，吸光值为横坐标，绘出标准曲线。

7、根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量。

四、SDS-PAGE电泳

1、将抗原（组织/细胞裂解液）样品体积：5×loading buffer体积=4：1，混匀，在100℃加热5分钟以使蛋白质变性。

2、设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样。蛋白质量（蛋白质混合物）：40µg。

3、把电泳装置与电源连接好，将电压调至100V，电流应流向阳极，待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5cm处，关闭电源。

4、从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用去离子水冲洗干净。准备进行免疫印操作。

五、免疫印迹操作-转膜

1、将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中。

2、带上手套，裁剪好滤纸（Whatman, 3MM CHR）和PVDF膜，滤纸和膜大小为83mm×75mm，尽量避免污染滤纸和膜，将裁减好的滤纸和活化好的PVDF膜浸泡与电泳转移缓冲液中。

3、打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的Whatman,3MM滤纸。

4、小心将凝胶放置于滤纸上，避免气泡。

5、将另一块海绵用转移缓冲液浸透后放在凝胶-膜“三明治”上，关上转移盒并插入转移槽。

6、将冰盒装入缓冲液槽，注满4℃预冷的转移缓冲液。

7、连接好转移电极恒流300mA转移90min。

8、电转完毕后，将电转膜置于5%的脱脂奶粉（TBST配制）中封闭，磷酸化指标用5%的BSA（TBST配制）封闭，37℃ 1小时。

六、免疫检测

一抗与靶蛋白的结合

1、封闭的膜用TBST漂洗2次。

2、将加样槽洗涤干净，用蒸馏水润洗，晾干，将膜用一次性手套覆盖好，按标记和实验设计切下膜条按顺序置于加样槽中，作好实验记录，加入相应的一抗。

3、一抗孵育4℃过夜。

4、弃去一抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加2-3 ml TBST，上摇床洗涤洗涤5min，换液，反复4次。

酶标记二抗与一抗的结合

1、根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度（TBST稀释），每个加样槽中加入二抗室温下于摇床孵育1h，注意保证膜的所有部分同溶液接触。

2、弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加2-3 ml TBST，上摇床洗涤洗涤5min，换液，反复4次。

七、化学发光

将膜吸去多余TBST，将膜浸入配制好的ECL中，室温下孵育1分钟并轻轻摇动。将膜取出并吸走多余的反应底物（但不要使它晾干），包在保鲜膜中然后将膜放入荧光化学发光凝胶成像系统，成像得到图片。