Real Time PCR 实验步骤

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名称	厂家	型号
AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix	南京诺唯赞生物科技有限公司	Q511-02
HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)	南京诺唯赞生物科技有限公司	R212-02
琼脂糖	擎科生物	TSJ001
无水乙醇	国药集团化学试剂有限公司	10009218
Gold view	北京艾德莱生物科技有限公司	EP0601
Trans2K®Plus II DNA Marker	北京全式金生物技术股份有限	BM121-01
三氯甲烷	国药集团化学试剂有限公司	10006818
异丙醇	国药集团化学试剂有限公司	80109218
TRIpure Reagent	北京艾德莱生物科技有限公司	RN0102
DEPC	上海生工	B600154-0025

1、总RNA抽提: 样本前处理。

1.1、组织：取匀浆管，加入1ml的TRIpure Reagent，置冰上预冷。取约20 mg组织，加入到匀浆管中。匀浆仪充分研磨直至无可见组织块。

1.2.贴壁细胞：将培养瓶/板中培养液尽弃，加入1ml 4℃ 预冷的PBS溶液，轻摇洗涤。除去PBS，加入1ml的TRIpure Reagent，轻缓振荡或用枪头吹打，破碎细胞。

1.3.悬浮细胞：3000 rpm，离心10分钟，收集细胞沉淀，加入1ml 4℃ 预冷的PBS溶液重悬细胞，3000 rpm，离心10分钟，收集细胞沉淀，加入1ml的TRIpure Reagent，轻缓振荡或用枪头吹打，破碎细胞。

2. 相分离：加入200 μl三氯甲烷，颠倒充分混匀，静置3min，4℃ 下12000rpm离心10min，将400 μl上清转移到一新的离心管中。TBST清洗切片，浸洗3次，每次5分钟。

3、洗涤RNA：吸除液体，加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀。4℃下12000rpm离心5min，将液体吸除干净。

4、溶解RNA：将离心管置于超净台上吹3min，加入30μl DEPC水溶解RNA，55℃ 孵育5min。

5、RNA质量检测：用酶标仪检测RNA浓度及纯度，电泳检测RNA的完整行。

6、反转录

基因组DNA去除

用移液器轻轻吹打混匀。42℃ 2 min。

7、配制第一链cDNA合成反应液。

8、逆转录程序设置

9、荧光定量PCR实验步骤

9.1 引物的配制

9.1.1 将引物瞬时离心；

9.1.2 按照说明书加入去离子水，加盖混匀，配成100uM/L的贮存液；

9.1.3 另取一EP管，将上、下游引物稀释为10.0uM/L终浓度的工作液。

10、cDNA的配置：将cDNA从冰箱中取出，加入适量的去离子水，稀释至合适的浓度。

11、反应体系：取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。

Component	Volume
AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix	10μl
上游引物	0.4uL
下游引物	0.4uL
ddH2O	6.7μl
DNA（适度稀释）	2.5μl
DNA（适度稀释）	2.5μl
总体系	20μl

12、荧光定量PCR实验步骤:95℃ 5min；（95℃ 10s ；60℃ 30s）40次熔解曲线 60℃→95℃，每15s升温0.3℃

1、ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本);B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本);K=A-B 表达倍数=2-K