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番红O-固绿染色法的染色原理在于嗜碱性的软骨与碱性染料番红O结合呈现红色，嗜酸性的骨和酸性染料固绿结合而呈绿色，与呈现红色的软骨对比鲜明，从而将软骨组织和骨组织区分开。
番红O是一种结合多个阴离子的阳离子染料，其显示软骨组织是基于阳离子染料与多糖中阴离子基团（硫酸软骨素或硫酸角质素）结合。番红O着色与阴离子的浓度近似成正比关系，简介反映了基质中蛋白多糖的含量和分部。当软骨组织受到损伤时，软骨中的糖蛋白会释放出来，使基质成分分布不均匀，从而导致番红O淡染或不着色。通过图像分析软件可对番红O染色的软骨基质进行定量分析。固绿与胶原纤维结合，不宜褪色。
番红固绿染色常用于骨组织中，能将软骨组织和成骨组织区分开。番红固绿染色也可用于高等植物的根、茎、叶。番红是碱性染料，能显示维管束植物木质化、木栓化和角质化的组织；固绿是酸性染料，是一种染含有浆质的纤维素细胞组织的染色剂，在染细胞和植物组织上应用极广。导管可以被番红染色，筛管可以被固绿染色。
软骨呈鲜红色或橙红色，成骨呈绿色，部分结缔组织也呈红色。
脱蜡至水-固绿染色-洗涤-番红O染色-分化-脱水与透明-封片-显微镜镜检。
1、提供固定合格的样本。组织离体后，选择合适的固定液立即固定，固定液的量建议大于组织体积的10-15倍，新鲜标本用合适的容器固定24-48h，大标本固定12h，再切开固定。标本常温（24℃左右）或冷藏（4℃）固定，切勿冷冻结冰，固定样本常温运输送样。
2、石蜡切片常温运输，冰冻切片-20℃运输。
1、切片染色不好需重染时，可用自来水浸泡去除固绿颜色，用盐酸酒精浸泡去除番红颜色，将颜色全脱色后重新染即可。
2、染色时间稍有差异，会导致红色和绿色的差异较大，需注意镜下控制两种颜色的程度，自来水中能分化固绿的颜色，刚染完固绿的切片，软骨部位也会有较深的绿色着色，这时需要在自来水中分化至软骨部分绿色变浅或变成无色。但同时也要注意成骨部分的绿色颜色变化，若成骨部分颜色在分化时过浅，则需要重染固绿，再用自来水分化直到软骨部分绿色较浅或无色，成骨部分绿色较深。
3、番红O使用多次后会产生沉淀且不易着色，需及时更换染液。
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