mRNA检测原位杂交（地高辛探针）

服务介绍：

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异性探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。可以用直接法或间接法进行FISH。FISH的实验材料可以是间期细胞、分裂中期的染色体，也可以是冷冻或石蜡切片组织。

主要用途：

原位杂交技术可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性、定量及定位分析，可应用于：

1、细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图谱、基因表达的研究。

2、受感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位，如EB病毒mRNA、人乳头瘤病毒（HPV）DNA和巨细胞病毒DNA的检测。

3、癌基因、抑癌基因等在转录水平的表达及其变化的检测。

4、基因在染色体上的定位。

5、染色体数量异常和染色体易位等的检测。

6、分裂期间细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定等。

检测原理：

将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确的定量定位。

实验流程：

石蜡切片脱蜡至水-打孔液孵育-蛋白酶K消化-阻断内源性过氧化物酶-预杂交-洗涤-杂交-杂交后洗涤-封闭-孵育抗地高辛标记的HRP二抗-TSA染色-复染细胞核-脱水-封片-镜检。

样本要求及运输条件：

1、提供固定合格的样本。组织离体后，立即放入10%NBF或4%多聚甲醛固定液中，固定液需用DEPC水配制，在室温下固定16-32小时。固定时间少于16小时或长于32小时都会影响实验结果。石蜡切片常温运输。

2、新鲜冰冻组织样本取材后直接用OCT包埋，然后以10-20μm厚度进行切片。切片可以在-80℃保存至多3个月，在此步骤前不要对组织使用任何固定剂（乙醇或甲醛）。切片于干冰中运输。

3、固定组织做冰冻切片，样本取材后应立即放到新鲜制备的4%PFA中，4℃固定24小时。切片于-20℃运输。

4、细胞爬片用原位杂交固定液固定15分钟后，换无酶PBS，密封，4℃运输。

5、探针于干冰中运输至公司。

注意事项：

1、客户需提供探针及杂交靶目标（mRNA，LncRNA，circRNA，miRNA，DNA），探针包括目的探针、阳性对照探针及阴性对照探针。

2、若客户探针有对应的杂交缓冲液，请客户提供。若无，则使用公司所用的通用杂交缓冲液（北京天恩泽基因科技有限公司超级杂交液）。

3、原位杂交实验一般先做预实验然后进行正式实验，因为核酸容易降解，因此前期样本处理有特定要求，具体可与公司沟通。

4、正式实验的趋势我司不做保证。

5、原位杂交实验所用的超纯水、载玻片等实验器具均需要高压灭菌。若为关于RNA的原位杂交，则需要加入DEPC进行高压灭菌。